Structura și funcția cromatinei

Poziționarea nucleozomului

Genomul eucariot este împachetat într-o subunitate repetitivă cunoscută sub numele de nucleozom, care constă din 146 bp de ADN înfășurat aproape de două ori în jurul unui octamer de proteine histone de bază. Toate tranzacțiile ADN eucariote, de la transcriere la repararea ADN-ului și până la recombinare, au loc în contextul împachetării acestui ambalaj nucleosomal. Deoarece ADN-ul înfășurat în jurul nucleozomului și ADN-ul situat între nucleozomi diferă în ceea ce privește accesibilitatea și caracteristicile structurale, localizarea precisă a nucleozomilor de-a lungul genomului s-a dovedit a fi de mare importanță pentru înțelegerea funcției genomului. Într-un anumit sens, ne putem gândi la împachetarea cromatină a genomului ca la un „set de filtre” care afectează producția genomică prin ascunderea sau expunerea alternativă a unor elemente cheie de reglementare a ADN-ului, permițând aceleiași molecule de ADN să exprime mai multe programe funcționale distincte în funcție de starea sa precisă de împachetare. Laboratorul nostru este de mult timp interesat de biologia structurală a genomului – care sunt regulile care stau la baza împachetării genomului și care sunt implicațiile funcționale ale diferitelor stări de împachetare?

Ne-am concentrat pe drojdia înmugurită S. cerevisiae ca organism model convenabil pentru a studia structura cromatinei la nivelul întregului genom, unde am dezvoltat metode la nivelul întregului genom pentru analiza arhitecturii cromatinei. De exemplu, pentru a genera hărți genomice ale poziționării nucleozomilor, ne folosim de faptul că nucleaza micrococală (MNase) are preferință pentru ADN de legătură în detrimentul ADN-ului nucleosomal – separarea dimensională a fragmentelor de ADN rămase după digestia cu MNase are ca rezultat o „scară” regulată cu unități de mărime care se repetă. Analiza la nivelul întregului genom a fragmentelor de dimensiunea mononucleozomului rezultate prin matrice de tip „tiling array” sau prin secvențiere profundă (MNase-seq) oferă apoi un catalog al regiunilor protejate de nucleozomi (Yuan et al, Science 2005), dezvăluind atât locațiile nucleozomilor „bine poziționați” care sunt prezenți în același loc în majoritatea populației celulare, cât și locațiile regiunilor „neclare” în care locația nucleozomilor variază de la o celulă la alta. Printre cele mai mari surprize ale acestor hărți timpurii ale nucleozomilor s-a numărat faptul că majoritatea nucleozomilor (~70%) din drojdia înmugurită sunt relativ bine poziționați, în ciuda faptului, de mult timp înțeles, că marea majoritate a ADN-ului genomic are o preferință termodinamică intrinsecă mică sau deloc pentru încorporarea în nucleozomi. Am continuat să investigăm aspecte ale poziționării nucleozomilor în drojdia înmugurită, utilizând atât abordări genetice tradiționale (Weiner et al, Genome Res 2010), cât și studii genomice comparative (Tsankov et al, PLoS Bio 2010, Hughes et al, Mol Cell 2012) pentru a ilumina forțele responsabile de poziționarea nucleozomilor in vivo.

Lecțiile învățate din hărțile nucleozomilor din drojdie s-au dovedit în mare măsură generale într-o multitudine de specii supuse cartografierii nucleozomilor la nivelul întregului genom, apărând o serie de concepte-cheie (Figura 1). În primul rând, promotorii activi și poziționați sunt lipsiți de nucleozomi, la fel ca și intensificatorii activi. În al doilea rând, nucleozomii care mărginesc elementele de reglementare sunt bine poziționați. Nucleozomii sunt poziționați cu o precizie din ce în ce mai mică la distanțe mai mari, ceea ce duce la un șablon nucleozomic mai neclar la o distanță mai mare (~1000-2000bp) de nucleozomii de graniță. În al treilea rând, genele puternic transcrise tind să aibă o ocupare mai scăzută a nucleozomilor și o poziționare mai puțin precisă, cel mai probabil datorită acțiunii ARN polimerazei II și a factorilor săi asociați. În cele din urmă, densitatea șablonului nucleozomilor (distanța medie dintre doi nucleozomi adiacenți) poate varia, în principal din cauza factorilor trans. Continuăm să studiem poziționarea nucleozomilor într-o oarecare măsură în drojdie, cu un interes activ în descompunerea cu o singură moleculă a măsurătorilor de ansamblu.

Dinamica histonilor

Sesajele epigenomice captează instantanee ale unor stări celulare complexe. Spre deosebire de secvența ADN, care este extrem de stabilă, cromatina poate fi extrem de dinamică, ceea ce ridică problema scărilor temporale relevante care guvernează structurile de cromatină. Această întrebare este legată, dar distinctă, de cea a eterogenității în cadrul unei populații celulare. Atunci când observăm un nucleozom „neclar” într-o măsurătoare de ansamblu, locația nucleozomului se schimbă doar la diviziunea celulară (stabilă) sau la fiecare câteva secunde (dinamică) – o gamă largă de scări temporale este în concordanță atât cu observația de ansamblu, cât și cu distribuția stărilor celulelor unice. Această întrebare este valabilă pentru întreaga gamă de structuri întâlnite in vivo, de la interacțiunile cromozomiale cu rază lungă de acțiune până la modificările chimice ale nucleozomului. Înțelegerea funcției structurilor observate va necesita, în cele din urmă, cunoașterea scărilor de timp relevante pentru structurile în cauză.

Pentru a caracteriza dinamica cromatinei la nivelul întregului genom, am adaptat metodele pule-chase codificate genetic pentru a caracteriza ratele de rotație a nucleozomilor independente de replicare la nivelul întregului genom (Dion et al, Science 2007). Aceste studii relevă o rotație independentă de replicare la nivelul genelor transcrise, cu o înlocuire deosebit de rapidă a histonilor care are loc în regiunile de reglementare (promotori și intensificatori). Studiile mutante din multe laboratoare, inclusiv al nostru, au permis o înțelegere mecanică a mașinăriei celulare responsabile de înlocuirea histonelor.

Pe scări de timp mai lungi, problema dinamicii histonelor este esențială pentru orice înțelegere mecanică a modului în care stările de cromatină sunt copiate de la o generație la alta. Pentru a înțelege mecanismul prin care stările de cromatină ar putea fi moștenite, este necesar să se înțeleagă provocările unice pe care le ridică dinamica proteinelor histone în timpul replicării. În primul rând, în timpul replicării genomice, trecerea furcii de replicare întrerupe contactele histonă-ADN, iar histonele vechi trebuie să se reasocieze cu cromozomii fiice într-o locație apropiată de locația lor inițială pe cromozomul mamă. În caz contrar, informațiile epigenetice specifice locusului ar fi amestecate la întâmplare la fiecare generație. În al doilea rând, histonele vechi reprezintă doar o jumătate din histonele de pe fiecare genom nou, iar histonele rămase sunt sintetizate din nou în timpul fiecărei faze S. Acest lucru implică o anumită trecere a informației de la histonele vechi la cele noi, deoarece, în caz contrar, vechile stări ale cromatinei ar fi rapid diluate de noile histone.

Pentru a încerca să măsurăm amploarea mișcării nucleozomilor în timpul replicării genomului, am utilizat un sistem genetic de impulsuri de urmărire dezvoltat de laboratorul van Leeuwen, în care inducerea recombinării Cre-Lox are ca rezultat o trecere de la o histonă H3 marcată cu un epitop la o nouă etichetă epitopică. Acest sistem ne-a permis să dezactivăm o etichetă H3 ancestrală și, ulterior, să urmărim dispoziția genomică a H3 ancestrală timp de mai multe diviziuni celulare (Radman-Livaja et al, PLoS Bio 2011). Spre marea noastră surpriză, am constatat că proteinele histone vechi nu se acumulează la loci reglați epigenetic, cum ar fi subtelomerii, ci se acumulează la capetele 5′ ale genelor lungi, slab transcrise. Așa cum era de așteptat, histonele vechi nu se acumulează la loci care prezintă o reînnoire rapidă a histonelor, dar am constatat, de asemenea, că mișcarea de la 3′ la 5′ a histonelor vechi de-a lungul regiunilor de codificare și mișcarea histonelor în timpul replicării sunt necesare pentru a explica modelele de retenție a histonelor ancestrale pe care le observăm. Cel mai important, am descoperit că histonele vechi nu se reasociază cu genomurile fiice exact la locul de unde s-au disociat, ci, în schimb, că histonele materne rămân la ~400 bp de locația lor originală în timpul replicării, oferind prima măsură a acestui parametru crucial. Astfel, orice moștenire a stărilor de cromatină trebuie să aibă loc la scara domeniilor de ~5-10 nucleozomi, mai degrabă decât la rezoluția unui singur nucleozom. Aceste rezultate constrâng, prin urmare, cantitatea maximă de informație transportată teoretic de cromatină între generații.

Modificări histonice

Structura de mărgele pe o sfoară a fibrei de cromatină nu este compusă din mărgele uniforme, deoarece compoziția chimică a nucleozomilor individuali poate fi, în principiu, extrem de variabilă de la un nucleozom la altul, cu consecințe importante pentru funcția genomului. Cel mai dramatic este faptul că proteinele histone pot fi modificate chimic, având loc o varietate prodigioasă de modificări post-traducționale (acetilare, metilare, fosforilare, ubiquitylare și multe altele) la mai multe reziduuri din toate histonele. Aceste modificări chimice pot altera proprietățile chimice și fizice ale nucleozomului, dar servesc, de asemenea, pentru a modula legarea de către proteinele care recunosc starea modificată (de exemplu, se leagă numai de H3K4 tri-metilat).

Această diversitate incredibilă de modificări histonice conduce în mod natural la întrebarea ce înseamnă toate acestea – de ce apar atât de multe modificări histonice în celulă? Suntem de mult timp interesați de întrebarea privind modul în care complexitatea combinatorie contribuie la reglarea cromatinei. Câte combinații distincte de modificări apar (Figura 2) și pot fi potrivite combinații specifice de modificări cu rezultate specifice, astfel încât codul să poată fi descifrat? Am adoptat două abordări ale acestor întrebări, bazate pe 1) cartografierea la nivel de genom a modificărilor histonice la rezoluția mononucleozomului (Liu et al, PLoS Bio 2005, Weiner et al, Mol Cell 2015) și 2) analiza modificărilor transcripționale în drojdia înmugurită purtătoare fie de histone mutante, fie de deleții ale enzimelor modificatoare de histone (Dion et al, PNAS 2005, Weiner et al, PLoS Bio 2012).

Centrându-se mai întâi pe cartografierea genomică, eforturile pe scară largă de cartografiere a stării histonilor în mai multe sisteme model dezvăluie o serie de aspecte conservate ale structurii cromatinei. În primul rând, procesul de transcripție lasă o amprentă masivă pe cromatină, cu diferite modificări histonice depuse de formele de inițiere (capătul 5′ al genelor) și de alungire (capetele de mijloc și 3′) ale ARN polimerazei. Mărcile de la capătul 5′ al genelor includ di/tri-metilarea H3K4 (H3K4me3), hiperacetilarea cozii H3 și H4 (H3K4/9/14/18/27ac și H4K5/8/12ac), variantele H3.3 și H2A.Z și acetilarea H3K56. Nucleozomii din corpul genelor sunt de obicei marcați cu H3K36me3 și H3K79me3 și, în general, sunt oarecum lipsiți de acetilații ale cozii histonice. În al doilea rând, elementele de reglare distale, cum ar fi amelioratorii, sunt marcate cu H3K4me1/2, dar nu cu H3K4me3. Alte mărci histonice diferențiază potențatorii reprimați, pregătiți și activi, cu metilarea și acetilarea H3K27 marcând potențatorii reprimați și, respectiv, activi. În al treilea rând, două forme majore de cromatină represivă sunt asociate cu modificări histonice specifice. Heterocromatina clasică (inclusiv telomerii și multe secvențe repetitive) este marcată cu metilarea H3K9, în timp ce genele reprimate de factorii din grupul polycomb sunt marcate cu H3K27me3. Nucleozomii metilați cu H3K27 pot fi fie în stare reprimată și lipsiți de alte marcaje, fie în stare „bivalentă”, în combinație cu marcajul activ H3K4me3. În cele din urmă, nucleozomii asociați cu centromerii conțin adesea proteina CENP-A asemănătoare cu H3, iar în timpul fazei M, un domeniu pericentric larg de nucleozomi este marcat cu H3S10ph. În general, există o corespondență izbitoare a stării histonice cu funcția regiunilor genomice și, datorită acestui fapt, cartografierea modificărilor histonice este o metodă eficientă pentru a descoperi gene și elemente de reglare.

Cu privire la funcțiile modificărilor histonice, o abordare sistematică pentru a înțelege funcțiile modificărilor histonice combinatorii a fost analiza întregului genom a modificărilor expresiei genice observate la mutanții histonici. Astfel de studii constată, de obicei, că mutanții histonici prezintă o complexitate fenotipică relativ mică rezultată din diferite combinații de mutanți histonici. Acest lucru se observă atât în studiile care se concentrează asupra mutanților punctiformi specifici ai histonelor și a combinațiilor acestora, cât și în studiile care se concentrează asupra mutanților de deleție ai enzimelor modificatoare de histone. De exemplu, am examinat sistematic toate cele 16 mutații combinatorii posibile între cele 4 lizine din coada histonei H4, constatând că mutația a trei dintre reziduuri (lizinele 5, 8 și 12) a avut efecte nediferențiate asupra expresiei genice, în timp ce lizina 16 a fost confirmată ca având efecte unice asupra expresiei genice (Dion et al, PNAS 2005). Mai mult, defectele de expresie a genelor în mutanții combinatoriali au fost puțin diferite de combinațiile liniare ale mutațiilor componente – cu alte cuvinte, efectul mutantului dublu H4K5,16R asupra expresiei genelor ar putea fi prezis prin adăugarea împreună a seturilor de date K5R și K16R.

În contrast cu efectele modeste ale multor deleții modificatoare de histone observate în starea de echilibru, studiile pe o singură genă sugerează că regulatorii de cromatină au roluri importante în procesele dinamice care sunt mascate în starea de echilibru. Acest lucru ne-a motivat să studiem regulatorii de cromatină în contextul reprogramării transcripționale, folosind stresul cu diamidă în drojdie ca o paradigmă convenabilă pentru a induce modificări transcripționale masive (Weiner et al, PLoS Bio 2012). Am constatat că majoritatea regulatorilor de cromatină au efecte mai mari asupra cineticii de inducție/reprimare a genelor decât asupra nivelurilor de ARNm în stare staționară, confirmând că studiile dinamice pot identifica funcții neanticipate pentru regulatorii de cromatină. Gruparea mutanților de deleție cu defecte similare de expresie genică identifică complexe cunoscute și faptul că analiza comună a mutanților de histone și a mutanților de deleție asociază multe enzime modificatoare de histone cu situsurile lor țintă. Prin combinarea datelor funcționale cu datele de cartografiere la nivelul întregului genom, am identificat un rol surprinzător pentru metilarea H3K4 dependentă de Set1 (o marcă de „activare”) în reprimarea genelor de biogeneză ribozomală. Împreună, aceste date oferă o viziune multimodală bogată asupra rolului regulatorilor de cromatină în dinamica inducerii și reprimării genelor și sugerează că înțelegerea nenumăratelor roluri ale structurii cromatinei în reglarea genelor la scara întregului genom va necesita extinderea analizelor mutante la studii cinetice.

Plasarea cromozomului

În timp ce structura unidimensională a cromatinei este din ce în ce mai bine înțeleasă, înțelegerea noastră a pliajului tridimensional al genomului în nucleu a rămas în mod tradițional în urmă. Acestea fiind spuse, în ultimul deceniu, acest decalaj a fost drastic redus datorită dezvoltării de către Dekker și colegii săi a familiei de tehnici 3C (Chromosome Conformation Capture). În aceste metode, cromatina este supusă unei reticulații in vivo pentru a capta interacțiunile dintre loci cromozomiali. Genomul este apoi fragmentat, de obicei cu enzime de restricție, iar ligatura ADN este utilizată pentru a capta interacțiunile dintre loci cromozomiali care au fost în contact unul cu celălalt in vivo. Abundența produselor de ligare între două regiuni cromozomiale este adesea interpretată ca o măsură a frecvenței/probabilității de contact, sau de proximitate, între perechile de loci, oferind o imagine a structurii cromozomiale care este oarecum analogă cu imaginea structurii proteinelor generată de tehnicile RMN. Variantele de 3C la nivelul întregului genom, cum ar fi Hi-C, au dezvăluit o serie de caracteristici organizaționale ale genomurilor eucariote la rezoluții din ce în ce mai fine, de la scara teritoriilor cromozomiale complete, la compartimente active și inactive de mai mulți Mb, la domenii de contact de sute de kb (TAD), la bucle potențiator-promoter.

În timp ce mulți factori au un impact asupra rezoluției efective a unui set de date 3C/Hi-C, inclusiv adâncimea de secvențiere și complexitatea bibliotecii, o limită crucială a rezoluției genomice este dimensiunea fragmentelor generate înainte ca interacțiunile fizice să fie capturate prin ligare. Deoarece majoritatea experimentelor bazate pe 3C se bazează pe enzimele de restricție pentru fragmentarea genomului, acestea sunt limitate la o rezoluție de ~1 kb în cel mai bun caz. Pentru a îmbunătăți rezoluția tehnicilor bazate pe 3C, am dezvoltat, prin urmare, o tehnică de înaltă rezoluție bazată pe 3C, denumită „Micro-C”, în care fragmentarea genomului se realizează cu ajutorul nucleazei micrococice (MNase) pentru a permite analiza la rezoluție mononucleosomică a pliajului cromozomilor. Rezoluția îmbunătățită oferită de Micro-C a permis identificarea domeniilor de interacțiune cromozomială – „CID” – în drojdia înmugurită, care nu fuseseră apreciate anterior cu ajutorul unei tehnici 3C bazate pe enzime de restricție (Hsieh et al, Cell 2015). Un protocol Micro-C revizuit care încorporează reticulatori lungi, pe care l-am numit „Micro-C XL”, nu numai că a recapitulat structurile locale de cromatină dezvăluite anterior de Micro-C, dar a recuperat în mod robust și caracteristicile de ordin superior, cum ar fi interacțiunile centromerice-centromerice (Hsieh et al, Nature Methods 2016).

Metoda noastră oferă informații despre plierea genomului de drojdie la toate scările de lungime de interes. La scări mai mari, configurația Rabl a cromozomilor este văzută ca o grupare a centromerelor și interacțiuni între telomerii brațelor cromozomiale de lungime similară. Cromatina centromerică prezintă, de asemenea, o formă caracteristică de „X”, care rezultă din faptul că cele două brațe ale cromozomului se îndepărtează statistic de centromer împreună într-o structură în formă de ac de păr pe o lungime de aproximativ ~20 kb, în timp ce centromerii sunt relativ izolați de brațele cromozomilor. La o rezoluție mai mare (figura 3), genele, atât la drojdia înmugurită, cât și la drojdia de fisiune, sunt organizate în domenii de interacțiune cromozomială (CID), care cuprind de obicei 1-5 gene și care sunt, într-un fel, similare „domeniilor de asociere topologică” descrise într-o multitudine de alte organisme model. Limitele dintre CID-uri apar la nivelul promotorilor activi, al genelor puternic exprimate și al genelor ARNt. Concordanța mai multor abordări independente ale analizei replierii cromozomilor oferă speranța că ne apropiem de o înțelegere reală a structurilor adoptate de cromozomi în celulă.

.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.