Struktura i funkcja chromatyny

Pozycjonowanie nukleosomów

Genom eukariotyczny jest zapakowany w powtarzającą się podjednostkę znaną jako nukleosom, która składa się z 146 bp DNA owiniętego prawie dwukrotnie wokół oktameru podstawowych białek histonowych. Wszystkie eukariotyczne transakcje DNA, od transkrypcji do naprawy DNA do rekombinacji, występują w kontekście opakowania tego nukleosomalnego opakowania. Ponieważ DNA owinięty wokół nukleosomu i DNA znajdujący się pomiędzy nukleosomami różnią się dostępnością i cechami strukturalnymi, dokładne lokalizacje nukleosomów wzdłuż genomu okazały się mieć ogromne znaczenie dla zrozumienia funkcji genomu. W pewnym sensie można myśleć o chromatynowym upakowaniu genomu jako o „zestawie filtrów”, który wpływa na wydajność genomu poprzez naprzemienne ukrywanie lub odsłanianie kluczowych elementów regulacyjnych DNA, pozwalając tej samej cząsteczce DNA wyrażać wiele różnych programów funkcjonalnych w zależności od jej precyzyjnego upakowania. Nasze laboratorium od dawna interesuje się biologią strukturalną genomu – jakie zasady leżą u podstaw upakowania genomu i jakie są funkcjonalne implikacje różnych stanów upakowania? Skupiliśmy się na drożdżach pączkujących S. cerevisiae jako wygodnym organizmie modelowym do badania struktury chromatyny w całym genomie, gdzie opracowaliśmy metody analizy architektury chromatyny w całym genomie. Na przykład, do generowania genomowych map położenia nukleosomów wykorzystujemy fakt, że nukleaza mikrokalkowa (MNase) preferuje DNA łącznikowe w stosunku do DNA nukleosomalnego – separacja wielkościowa fragmentów DNA pozostałych po trawieniu MNase daje w efekcie regularną „drabinkę” o powtarzających się jednostkowych rozmiarach. Analiza w skali całego genomu powstałych fragmentów o rozmiarach mononukleosomów za pomocą tiling array lub głębokiego sekwencjonowania (MNase-seq) dostarcza następnie katalogu regionów chronionych przez nukleosomy (Yuan i in., Science 2005), ujawniając zarówno lokalizacje „dobrze ustawionych” nukleosomów, które są obecne w tym samym miejscu w większości populacji komórek, jak i lokalizacje „rozmytych” regionów, w których położenie nukleosomów różni się pomiędzy komórkami. Jedną z największych niespodzianek z tych wczesnych map nukleosomów był fakt, że większość nukleosomów (~70%) w pączkujących drożdżach jest stosunkowo dobrze umiejscowiona, pomimo od dawna znanego faktu, że ogromna większość genomowego DNA ma niewielką lub żadną wewnętrzną termodynamiczną preferencję do wbudowywania się w nukleosomy. Kontynuowaliśmy badania nad aspektami pozycjonowania nukleosomów w drożdżach pączkujących, używając zarówno tradycyjnych metod genetycznych (Weiner i wsp., Genome Res 2010), jak i porównawczych badań genomicznych (Tsankov i wsp., PLoS Bio 2010, Hughes i wsp., Mol Cell 2012), aby naświetlić siły odpowiedzialne za pozycjonowanie nukleosomów in vivo.

Wnioski wyciągnięte z map nukleosomów drożdży okazały się w dużej mierze ogólne u wielu gatunków podlegających mapowaniu nukleosomów w całym genomie, z kilkoma kluczowymi koncepcjami wyłaniającymi się (Rysunek 1). Po pierwsze, aktywne i zablokowane promotory są pozbawione nukleosomów, podobnie jak aktywne enhancery. Po drugie, nukleosomy graniczące z elementami regulatorowymi są dobrze umiejscowione. Nukleosomy są pozycjonowane z malejącą precyzją w większych odległościach, co prowadzi do rozmycia szablonu nukleosomowego w dalszej odległości (~1000-2000bp) od nukleosomów granicznych. Po trzecie, wysoko transkrybowane geny mają tendencję do mniejszej zajętości nukleosomów i mniej precyzyjnego pozycjonowania, najprawdopodobniej z powodu działania polimerazy RNA II i związanych z nią czynników. Wreszcie, gęstość szablonu nukleosomów (średnia odległość między dwoma sąsiednimi nukleosomami) może się różnić, głównie z powodu czynników trans. Kontynuujemy badania nad pozycjonowaniem nukleosomów w pewnym stopniu w drożdżach, z aktywnym zainteresowaniem w dekompozycji pojedynczych cząsteczek pomiarów zespołowych.

Dynamika histonów

Atesty epigenomowe wychwytują migawki złożonych stanów komórkowych. W przeciwieństwie do sekwencji DNA, która jest wysoce stabilna, chromatyna może być wysoce dynamiczna, co rodzi pytanie o odpowiednie skale czasowe, które rządzą strukturami chromatyny. Pytanie to jest związane z kwestią heterogeniczności w obrębie populacji komórek, ale jest od niej odrębne. Kiedy obserwujemy „rozmyty” nukleosom w pomiarze zespołowym, czy położenie nukleosomu zmienia się tylko przy podziale komórki (stabilne) czy co kilka sekund (dynamiczne) – szeroki zakres skal czasowych jest zgodny zarówno z obserwacją zespołową, jak i rozkładem stanów pojedynczych komórek. Pytanie to dotyczy całego zakresu struktur występujących in vivo, od dalekosiężnych oddziaływań chromosomalnych do chemicznych modyfikacji nukleosomów. Zrozumienie funkcji obserwowanych struktur będzie ostatecznie wymagało poznania odpowiednich skal czasowych dla struktur, o których mowa.

Aby scharakteryzować dynamikę chromatyny w całym genomie, dostosowaliśmy genetycznie zakodowane metody pule-chase, aby scharakteryzować niezależne od replikacji wskaźniki obrotu nukleosomów w całym genomie (Dion i inni, Science 2007). Badania te ujawniają niezależną od replikacji rotację w transkrybowanych genach, ze szczególnie szybką wymianą histonów zachodzącą w regionach regulatorowych (promotorach i enhancerach). Badania mutantów z wielu laboratoriów, w tym naszego, umożliwiły mechanistyczny wgląd w maszynerię komórkową odpowiedzialną za wymianę histonów.

W dłuższych skalach czasowych, kwestia dynamiki histonów jest kluczowa dla każdego mechanistycznego zrozumienia, jak stany chromatyny są kopiowane z pokolenia na pokolenie. Aby zrozumieć mechanizm, dzięki któremu stany chromatyny mogłyby być dziedziczone, konieczne jest zrozumienie unikalnych wyzwań stawianych przez dynamikę białek histonowych podczas replikacji. Po pierwsze, podczas replikacji genomowej przejście widełek replikacyjnych zaburza kontakty histon-DNA, a stare histony muszą ponownie przyłączyć się do chromosomów potomnych w miejscu zbliżonym do ich pierwotnej lokalizacji na chromosomie macierzystym. W przeciwnym razie, specyficzna dla danego locus informacja epigenetyczna byłaby losowo wymieszana w każdym pokoleniu. Po drugie, stare histony stanowią tylko połowę histonów na każdym nowym genomie, a pozostałe histony są na nowo syntetyzowane podczas każdej fazy S. To implikuje pewien przepływ informacji od starych histonów do nowych. To implikuje pewne przejście informacji od starych do nowych histonów, ponieważ w przeciwnym razie stare stany chromatyny zostałyby szybko rozcieńczone przez nowe histony.

Aby spróbować zmierzyć zakres ruchu nukleosomów podczas replikacji genomu, wykorzystaliśmy genetyczny system pulse-chase opracowany przez laboratorium van Leeuwen, w którym indukcja rekombinacji Cre-Lox powoduje przełączenie z jednego znacznika epitopowego histonu H3 na nowy znacznik epitopowy. System ten umożliwił nam wyłączenie znacznika przodka H3, a następnie śledzenie genomowego rozmieszczenia przodka H3 przez kilka podziałów komórkowych (Radman-Livaja i wsp., PLoS Bio 2011). Ku naszemu wielkiemu zaskoczeniu, odkryliśmy, że stare białka histonowe nie gromadzą się w epigenetycznie regulowanych loci, takich jak subtelomery, ale zamiast tego gromadzą się na 5′ końcach długich, słabo transkrybowanych genów. Zgodnie z oczekiwaniami, stare histony nie gromadzą się w loci wykazujących szybką rotację histonów, ale stwierdziliśmy również, że ruch 3′ do 5′ starych histonów wzdłuż regionów kodujących i ruch histonów podczas replikacji są wymagane do wyjaśnienia wzorów retencji histonów przodków, które obserwujemy. Co najważniejsze, stwierdziliśmy, że stare histony nie łączą się ponownie z genomami potomnymi dokładnie w tym miejscu, z którego się odłączyły, ale zamiast tego histony matczyne pozostają w obrębie ~400 bp od swojej pierwotnej lokalizacji podczas replikacji, dostarczając pierwszego pomiaru tego kluczowego parametru. Tak więc, jakiekolwiek dziedziczenie stanów chromatyny musi zachodzić w skali ~5-10 domen nukleosomowych, a nie w rozdzielczości pojedynczego nukleosomu. Wyniki te ograniczają zatem maksymalną ilość informacji teoretycznie przenoszonej przez chromatynę między pokoleniami.

Modyfikacje histonów

Struktura koralików na sznurku włókna chromatyny nie składa się z jednolitych koralików, ponieważ chemiczny makijaż poszczególnych nukleosomów może być w zasadzie bardzo zmienny od nukleosomu do nukleosomu, z ważnymi konsekwencjami dla funkcji genomu. Co najbardziej dramatyczne, białka histonowe mogą być modyfikowane chemicznie, z ogromną różnorodnością modyfikacji potranslacyjnych (acetylacja, metylacja, fosforylacja, ubikwitylacja i wiele innych) zachodzących w wielu resztach wszystkich histonów. Te chemiczne modyfikacje mogą zmieniać chemiczne i fizyczne właściwości nukleosomu, ale także służyć do modulowania wiązania przez białka, które rozpoznają zmodyfikowany stan (np. wiążą się tylko z trójmetylowanym H3K4).

Ta niesamowita różnorodność modyfikacji histonów prowadzi naturalnie do pytania, co to wszystko znaczy – dlaczego tak wiele modyfikacji histonów występuje w komórce? Od dawna interesowało nas pytanie, w jaki sposób złożoność kombinatoryczna przyczynia się do regulacji chromatyny. Jak wiele różnych kombinacji modyfikacji występuje (Rysunek 2) i czy konkretne kombinacje modyfikacji mogą być dopasowane do konkretnych wyników, tak aby kod mógł zostać rozszyfrowany? Podjęliśmy dwa podejścia do tych pytań, oparte na 1) genomowym mapowaniu modyfikacji histonów w rozdzielczości mononukleosomowej (Liu i wsp., PLoS Bio 2005, Weiner i wsp., Mol Cell 2015) oraz 2) analizie zmian transkrypcyjnych w drożdżach pączkujących niosących albo zmutowane histony, albo delecje enzymów modyfikujących histony (Dion i wsp., PNAS 2005, Weiner i wsp., PLoS Bio 2012).

Skupiając się najpierw na mapowaniu genomicznym, zakrojone na szeroką skalę wysiłki w mapowaniu stanu histonów w wielu systemach modelowych ujawniają szereg konserwowanych aspektów struktury chromatyny. Po pierwsze, proces transkrypcji pozostawia ogromny ślad na chromatynie, z różnymi modyfikacjami histonów osadzonymi przez inicjacyjne (5′ koniec genów) i elongacyjne (środkowy i 3′ koniec) formy polimerazy RNA. Znaki na 5′ końcach genów obejmują di/tri-metylację H3K4 (H3K4me3), hiperacetylację ogona H3 i H4 (H3K4/9/14/18/27ac i H4K5/8/12ac), warianty H3.3 i H2A.Z oraz acetylację H3K56. Nukleosomy ciała genowego są zwykle znakowane H3K36me3 i H3K79me3 i są na ogół nieco pozbawione acetylacji ogonów histonowych. Po drugie, dystalne elementy regulatorowe, takie jak enhancery, są znakowane za pomocą H3K4me1/2, ale nie H3K4me3. Inne znaczniki histonowe rozróżniają represjonowane, opanowane i aktywne enhancery, przy czym metylacja i acetylacja H3K27 oznaczają odpowiednio represjonowane i aktywne enhancery. Po trzecie, dwie główne formy represyjnej chromatyny są związane ze specyficznymi modyfikacjami histonów. Klasyczna heterochromatyna (w tym telomery i wiele sekwencji repetytywnych) jest znakowana metylacją H3K9, podczas gdy geny represjonowane przez czynniki z grupy polikomb są znakowane H3K27me3. Nukleosomy z metylacj± H3K27 mog± znajdować się w stanie represji i być pozbawione innych znaczników lub w stanie „biwalentnym” w poł±czeniu z aktywnym znacznikiem H3K4me3. Wreszcie, nukleosomy związane z centromerami często zawierają białko H3-podobne CENP-A, a podczas fazy M szeroka perycentryczna domena nukleosomów jest znakowana H3S10ph. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje uderzająca zgodność stanu histonów z funkcją regionów genomowych, i z tego powodu mapowanie modyfikacji histonów jest skuteczną metodą odkrywania genów i elementów regulatorowych.

Wracając do funkcji modyfikacji histonów, jednym z systematycznych podejść do zrozumienia funkcji kombinatorycznych modyfikacji histonów była analiza całego genomu zmian ekspresji genów obserwowanych u mutantów histonów. Badania takie zazwyczaj wykazują, że mutanty histonowe wykazują stosunkowo niewielką złożoność fenotypową wynikającą z różnych kombinacji mutacji histonowych. Jest to widoczne zarówno w badaniach skupiających się na specyficznych histonowych mutacjach punktowych i ich kombinacjach, jak i w badaniach skupiających się na mutacjach delecyjnych enzymów modyfikujących histony. Na przykład, systematycznie badaliśmy wszystkie 16 możliwych mutacji kombinatorycznych wśród 4 lizyn w ogonie histonu H4, stwierdzając, że mutacje trzech reszt (lizyny 5, 8 i 12) miały nierozróżnialny wpływ na ekspresję genów, podczas gdy lizyna 16 miała unikalny wpływ na ekspresję genów (Dion et al, PNAS 2005). Co więcej, defekty ekspresji genów w mutacjach kombinatorycznych niewiele różniły się od liniowych kombinacji mutacji składowych – innymi słowy, wpływ podwójnej mutacji H4K5,16R na ekspresję genów mógł być przewidziany przez dodanie zestawów danych K5R i K16R razem.

W przeciwieństwie do skromnych efektów wielu delecji modyfikujących histony obserwowanych w stanie ustalonym, badania pojedynczych genów sugerują, że regulatory chromatyny mają ważne role w dynamicznych procesach, które są zamaskowane w stanie ustalonym. Zmotywowało nas to do zbadania regulatorów chromatyny w kontekście przeprogramowania transkrypcyjnego, z wykorzystaniem stresu diamidowego w drożdżach jako wygodnego paradygmatu do indukowania masywnych zmian transkrypcyjnych (Weiner i wsp., PLoS Bio 2012). Stwierdziliśmy, że większość regulatorów chromatyny ma większy wpływ na kinetykę indukcji/represji genów niż na poziom mRNA w stanie ustalonym, co potwierdza, że badania dynamiczne mogą zidentyfikować nieoczekiwane funkcje regulatorów chromatyny. Grupowanie mutantów delecyjnych z podobnymi defektami ekspresji genów identyfikuje znane kompleksy, a wspólna analiza mutantów histonowych i delecyjnych kojarzy wiele enzymów modyfikujących histony z ich miejscami docelowymi. Łącząc dane funkcjonalne z danymi dotyczącymi mapowania całego genomu, zidentyfikowaliśmy zaskakującą rolę zależnej od Set1 metylacji H3K4 (znak „aktywujący”) w represji genów biogenezy rybosomalnej. Łącznie, dane te dostarczają bogatego, wielomodalnego spojrzenia na rolę regulatorów chromatyny w dynamice indukcji i represji genów i sugerują, że zrozumienie niezliczonych ról struktury chromatyny w regulacji genów w skali całego genomu będzie wymagało rozszerzenia analiz mutantów na badania kinetyczne.

Fałdowanie chromosomów

Podczas gdy jednowymiarowa struktura chromatyny jest coraz lepiej rozumiana, nasze zrozumienie trójwymiarowego składania genomu w jądrze tradycyjnie pozostaje w tyle. W ciągu ostatniej dekady luka ta uległa znacznemu zmniejszeniu dzięki opracowaniu przez Dekkera i współpracowników rodziny technik 3C (Chromosome Conformation Capture). W tych metodach chromatyna jest poddawana sieciowaniu in vivo w celu uchwycenia interakcji pomiędzy chromosomalnymi loci. Genom jest następnie fragmentowany, zazwyczaj przy użyciu enzymów restrykcyjnych, a ligacja DNA jest wykorzystywana do wychwycenia interakcji pomiędzy loci chromosomalnymi, które były w kontakcie ze sobą in vivo. Obfitość produktów ligacji pomiędzy dwoma regionami chromosomów jest często interpretowana jako miara częstotliwości/prawdopodobieństwa kontaktu, lub bliskości, pomiędzy parą loci, dostarczając widoku struktury chromosomów, który jest nieco analogiczny do widoku struktury białka generowanego przez techniki NMR. Genomowe warianty 3C, takie jak Hi-C, ujawniły szereg cech organizacyjnych genomów eukariotycznych w coraz dokładniejszej rozdzielczości, od skali pełnych terytoriów chromosomalnych, do wielomegabajtowych aktywnych i nieaktywnych przedziałów, do stu-kilogramowych domen kontaktowych (TADs), do pętli enhancer-promoter.

Podczas gdy wiele czynników wpływa na efektywną rozdzielczość zestawu danych 3C/Hi-C, w tym głębokość sekwencjonowania i złożoność biblioteki, kluczowym ograniczeniem dla rozdzielczości genomowej jest rozmiar fragmentów generowanych przed uchwyceniem fizycznych interakcji poprzez ligację. Ponieważ większość eksperymentów opartych na 3C polega na enzymach restrykcyjnych do fragmentacji genomu, są one ograniczone w najlepszym przypadku do rozdzielczości ~1 kb. Aby poprawić rozdzielczość technik opartych na 3C, opracowaliśmy technikę opartą na 3C o wysokiej rozdzielczości, nazwaną „Micro-C”, w której fragmentacja genomu jest wykonywana przy użyciu mikrokapsułkowej nukleazy (MNase), aby umożliwić analizę składania chromosomów w rozdzielczości mononukleosomowej. Lepsza rozdzielczość zapewniona przez Micro-C umożliwiła identyfikację domen oddziałujących chromosomalnie – „CIDs” – w drożdżach pączkujących, które wcześniej nie zostały docenione przy użyciu techniki 3C opartej na enzymach restrykcyjnych (Hsieh i wsp., Cell 2015). Zmieniony protokół Micro-C zawierający długie crosslinkery, który nazwaliśmy „Micro-C XL”, nie tylko odtworzył lokalne struktury chromatyny wcześniej ujawnione przez Micro-C, ale również solidnie odzyskał cechy wyższego rzędu, takie jak interakcje centromer-centromer (Hsieh i wsp., Nature Methods 2016).

Nasza metoda zapewnia wgląd w składanie genomu drożdży we wszystkich interesujących nas skalach długości. W większych skalach, konfiguracja Rabl chromosomów jest widoczna jako grupowanie centromerów i interakcje między telomerami ramion chromosomów o podobnej długości. Chromatyna centromerowa wykazuje również charakterystyczny kształt „X”, wynikający z tego, że oba ramiona chromosomu statystycznie prowadzą od centromeru razem w strukturze przypominającej szpilkę do włosów przez około ~20 kb, podczas gdy centromery są względnie odizolowane od ramion chromosomów. W wyższej rozdzielczości (Rysunek 3), geny zarówno u drożdży pączkujących, jak i rozszczepionych są zorganizowane w chromosomalnie oddziałujące domeny (CIDs), typowo obejmujące 1-5 genów, które są pod pewnymi względami podobne do „domen topologicznie kojarzących” opisanych u wielu innych organizmów modelowych. Granice między CIDs występują przy aktywnych promotorach, genach o wysokiej ekspresji i genach tRNA. Zgodność wielu niezależnych podejść do analizy fałdowania chromosomów daje nadzieję, że zbliżamy się do prawdziwego zrozumienia struktur przyjmowanych przez chromosomy w komórce.

.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.