Chromatine Structuur en Functie

Plaatsing van het nucleosoom

Het eukaryote genoom is verpakt in een zich herhalende subeenheid die bekend staat als het nucleosoom, dat bestaat uit 146 bp DNA dat bijna tweemaal gewikkeld is rond een octamer van basische histon-eiwitten. Alle eukaryotische DNA-transacties, van transcriptie tot DNA-reparatie en recombinatie, vinden plaats in de context van de verpakking van deze nucleosomale verpakking. Aangezien het DNA dat rond het nucleosoom is gewikkeld en het DNA dat zich tussen nucleosomen bevindt verschillen qua toegankelijkheid en structurele kenmerken, zijn de precieze locaties van nucleosomen langs het genoom van groot belang gebleken om de functie van het genoom te begrijpen. In zekere zin kan men de chromatinepakking van het genoom beschouwen als een “filterset” die de genomische output beïnvloedt door belangrijke regulerende DNA-elementen afwisselend te verbergen of bloot te leggen, waardoor dezelfde DNA-molecule meerdere verschillende functionele programma’s tot expressie kan brengen, afhankelijk van de precieze verpakkingstoestand. Ons laboratorium is al lang geïnteresseerd in de structurele biologie van het genoom – wat zijn de regels die ten grondslag liggen aan genomische verpakking, en wat zijn de functionele implicaties van verschillende verpakkingstoestanden?

We hebben ons gericht op de ontluikende gist S. cerevisiae als een handig modelorganisme om chromatine structuur genoom-breed te bestuderen, waar we genoom-brede methoden hebben ontwikkeld voor de analyse van chromatine architectuur. Om bijvoorbeeld genomische kaarten van de positie van nucleosomen te genereren, maken wij gebruik van het feit dat micrococcal nuclease (MNase) een voorkeur heeft voor linker DNA boven nucleosomaal DNA – grootte scheiding van de DNA fragmenten die overblijven na MNase digestie resulteert in een regelmatige “ladder” met zich herhalende eenheidsgrootte. Genoombrede analyse van de resulterende fragmenten ter grootte van een mononucleosoom met behulp van een tiling array of door diepe sequencing (MNase-seq) levert vervolgens een catalogus op van nucleosoom-beschermde regio’s (Yuan et al, Science 2005), waarbij zowel locaties van “goed gepositioneerde” nucleosomen worden onthuld die in het grootste deel van de celpopulatie op dezelfde plaats aanwezig zijn, als locaties van “vage” regio’s waar de nucleosoom-locatie varieert tussen cellen. Een van de grootste verrassingen van deze vroege nucleosomenkaarten was het feit dat de meerderheid van de nucleosomen (~70%) in budding yeast relatief goed gepositioneerd zijn, ondanks het al lang bekende feit dat de overgrote meerderheid van het genomische DNA weinig tot geen intrinsieke thermodynamische voorkeur heeft voor incorporatie in nucleosomen. We zijn doorgegaan met het onderzoeken van aspecten van nucleosoompositionering in budding yeast, met behulp van zowel traditionele genetische benaderingen (Weiner et al, Genome Res 2010) als vergelijkende genomische studies (Tsankov et al, PLoS Bio 2010, Hughes et al, Mol Cell 2012) om de krachten te belichten die verantwoordelijk zijn voor nucleosoompositionering in vivo.

De lessen die zijn geleerd van gist nucleosomenkaarten zijn grotendeels algemeen gebleken in een veelheid van soorten onderworpen aan genoom-brede nucleosomen in kaart brengen, met een aantal belangrijke concepten naar voren (figuur 1). Ten eerste zijn actieve en geposeerde promotors nucleosoom-verarmd, net als actieve enhancers. Ten tweede, nucleosomen grenzend aan regulerende elementen zijn goed gepositioneerd. Nucleosomen worden met afnemende precisie op grotere afstanden gepositioneerd, wat leidt tot een vager nucleosoomtemplate verder weg (~1000-2000 bp) van grensnucleosomen. Ten derde hebben hooggetranscribeerde genen de neiging om een lagere nucleosoombezetting en een minder nauwkeurige positionering te hebben, waarschijnlijk als gevolg van de werking van RNA polymerase II en de daarmee geassocieerde factoren. Tenslotte kan de dichtheid van het nucleosome sjabloon (gemiddelde afstand tussen twee aangrenzende nucleosomen) variëren, meestal als gevolg van transfactoren. Wij blijven de nucleosoompositionering tot op zekere hoogte bestuderen in gist, met een actieve belangstelling voor de ontleding van ensemblemetingen op basis van één molecuul.

Histonendynamica

Epigenomische assays leggen momentopnamen vast van complexe cellulaire toestanden. In tegenstelling tot de DNA-sequentie, die zeer stabiel is, kan chromatine zeer dynamisch zijn, waardoor de vraag rijst op welke relevante tijdschalen chromatinestructuren worden bepaald. Deze vraag is verwant met, maar verschillend van, de vraag naar heterogeniteit binnen een celpopulatie. Wanneer we een “wazig” nucleosoom in een ensemblemeting waarnemen, verandert de plaats van het nucleosoom dan alleen bij de celdeling (stabiel) of om de paar seconden (dynamisch) – een breed scala van tijdschalen is consistent met zowel de ensemblewaarneming als de verdeling van eencellige toestanden. Deze vraag geldt voor het hele scala van in vivo gevonden structuren, van lange-afstands chromosomale interacties tot nucleosoom chemische modificaties. Inzicht in de functie van de waargenomen structuren zal uiteindelijk vereisen dat we de relevante tijdschalen voor de structuren in kwestie kennen.

Om chromatine dynamiek genoom-breed te karakteriseren, hebben we genetisch gecodeerde pule-chase methoden aangepast om replicatie-onafhankelijke nucleosoom omloopsnelheden genoom-breed te karakteriseren (Dion et al, Science 2007). Deze studies laten een replicatie-onafhankelijke turnover zien bij getranscribeerde genen, met bijzonder snelle histon-vervanging bij regulatorische gebieden (promotors en enhancers). Mutant studies van vele laboratoria, waaronder de onze, hebben mechanistische inzichten in de cellulaire machines die verantwoordelijk zijn voor histon vervanging mogelijk gemaakt.

Over langere tijdschalen, de vraag van histon dynamiek is de sleutel tot een mechanistisch begrip van hoe chromatine toestanden worden gekopieerd van de ene generatie naar de volgende. Om het mechanisme te begrijpen waarmee chromatine toestanden zouden kunnen worden overgeërfd, is het noodzakelijk om de unieke uitdagingen te begrijpen die de dynamica van histon-eiwitten tijdens replicatie met zich meebrengt. Ten eerste verstoort de passage van de replicatievork tijdens de genomische replicatie de histon-DNA contacten, en oude histonen moeten opnieuw associëren met dochterchromosomen op een locatie dicht bij hun oorspronkelijke locatie op het moederchromosoom. Anders zou de locus-specifieke epigenetische informatie elke generatie willekeurig door elkaar geschud worden. Ten tweede maken oude histonen slechts de helft uit van de histonen op elk nieuw genoom, en de resterende histonen worden tijdens elke S-fase opnieuw gesynthetiseerd. Dit impliceert enige informatie passage van oude naar nieuwe histonen, omdat anders oude chromatine toestanden snel zouden worden verdund door nieuwe histonen.

Om te proberen de mate van nucleosoom beweging tijdens genomische replicatie te meten, maakten we gebruik van een genetisch pulse-chase systeem ontwikkeld door het van Leeuwen laboratorium, waarin inductie van Cre-Lox recombinatie resulteert in een omschakeling van een epitoop-gemerkte histon H3 naar een nieuwe epitoop tag. Dit systeem stelde ons in staat om een voorouderlijk H3 label uit te schakelen en vervolgens de genomische dispositie van het voorouderlijke H3 gedurende meerdere celdelingen te volgen (Radman-Livaja et al, PLoS Bio 2011). Tot onze grote verrassing vonden we dat oude histon-eiwitten zich niet ophopen op epigenetisch gereguleerde loci zoals de subtelomeren, maar in plaats daarvan ophopen aan de 5′ uiteinden van lange, slecht getranscribeerde genen. Zoals verwacht accumuleren oude histonen niet op loci met een snelle histon turnover, maar we hebben ook gevonden dat 3′ naar 5′ verplaatsing van oude histonen langs coderende regio’s en histon-verplaatsing tijdens replicatie nodig zijn om de patronen van voorouderlijke histon-retentie te verklaren die we waarnemen. Het belangrijkste is dat we vinden dat oude histonen zich niet opnieuw associëren met dochter-genen op precies de locus waarvan ze gedissocieerd zijn, maar in plaats daarvan dat maternale histonen binnen ~400 bp van hun oorspronkelijke locatie blijven tijdens replicatie, waarmee we de eerste meting van deze cruciale parameter leveren. Dus, elke overerving van chromatine toestanden moet plaatsvinden op de schaal van ~5-10 nucleosoom domeinen in plaats van op enkele nucleosoom resolutie. Deze resultaten beperken daarom de maximale hoeveelheid informatie die theoretisch door chromatine tussen generaties wordt overgedragen.

Histonmodificaties

De kralen op een koord-structuur van de chromatinevezel bestaat niet uit uniforme kralen, omdat de chemische samenstelling van individuele nucleosomen in principe uiterst variabel kan zijn van nucleosoom tot nucleosoom, met belangrijke gevolgen voor de genoomfunctie. Het meest dramatisch is dat de histon-eiwitten chemisch gemodificeerd kunnen worden, waarbij een enorme variëteit aan post-translationele modificaties optreedt (acetylering, methylering, fosforylering, ubiquitylering, en nog veel meer) op meerdere residuen in alle histon-eiwitten. Deze chemische modificaties kunnen de chemische en fysische eigenschappen van het nucleosoom veranderen, maar ook dienen om de binding te moduleren door eiwitten die de gemodificeerde toestand herkennen (b.v. alleen binden aan tri-methylated H3K4).

Deze ongelooflijke diversiteit van histon-modificaties leidt natuurlijk tot de vraag wat dit allemaal betekent – waarom komen er zoveel histon-modificaties voor in de cel? Wij zijn al lang geïnteresseerd in de vraag hoe combinatorische complexiteit bijdraagt aan chromatineregulatie. Hoeveel verschillende combinaties van modificaties komen voor (Figuur 2), en kunnen specifieke combinaties van modificaties worden gekoppeld aan specifieke uitkomsten, zodat de code kan worden ontcijferd? We hebben deze vragen op twee manieren benaderd, gebaseerd op 1) het genoombreed in kaart brengen van histonmodificaties op mononucleosoomresolutie (Liu et al, PLoS Bio 2005, Weiner et al, Mol Cell 2015), en 2) analyse van transcriptionele veranderingen in budding gist met ofwel gemuteerde histonen of deleties van histonmodificerende enzymen (Dion et al, PNAS 2005, Weiner et al, PLoS Bio 2012).

Focus eerst op genomische kartering, grootschalige inspanningen in histon toestand in kaart brengen in meerdere modelsystemen onthullen een aantal geconserveerde aspecten van de chromatine structuur. Ten eerste, het proces van transcriptie laat een massieve voetafdruk achter op chromatine, met verschillende histon modificaties afgezet door de initiatie (5′ uiteinde van genen) en elongatie (midden en 3′ uiteinden) vormen van RNA polymerase. Markeringen aan de 5′-uiteinden van genen omvatten H3K4 di/tri-methylering (H3K4me3), H3- en H4-staarthyperacetylering (H3K4/9/14/18/27ac en H4K5/8/12ac), H3.3- en H2A.Z-varianten, en H3K56-acetylering. Genenlichaam nucleosomen zijn typisch gemarkeerd met H3K36me3 en H3K79me3, en zijn over het algemeen enigszins verarmd van histon staart acetylaties. Ten tweede worden distale regulerende elementen, zoals enhancers, gemarkeerd met H3K4me1/2 maar niet met H3K4me3. Andere histon markeringen onderscheiden gerepresseerde, geposeerde en actieve enhancers, waarbij H3K27 methylering en acetylering respectievelijk gerepresseerde en actieve enhancers markeren. Ten derde, twee belangrijke vormen van repressief chromatine zijn geassocieerd met specifieke histon modificaties. Klassiek heterochromatine (waaronder telomeren en veel repeterende sequenties) wordt gemarkeerd met H3K9-methylering, terwijl genen die worden onderdrukt door polycomb-groep factoren worden gemarkeerd met H3K27me3. H3K27-gemethyleerde nucleosomen kunnen zich ofwel in een onderdrukte toestand bevinden en andere markeringen ontberen, of in een gepoileerde “bivalente” toestand in combinatie met de actieve markering H3K4me3. Tenslotte bevatten nucleosomen die geassocieerd zijn met centromeren vaak het H3-achtige CENP-A eiwit, en tijdens de M-fase is een breed pericentrisch domein van nucleosomen gemarkeerd met H3S10ph. Over het geheel genomen is er een opvallende overeenkomst tussen de histon toestand en de functie van genomische regio’s, en hierdoor is het in kaart brengen van histon modificaties een effectieve methode om genen en regulerende elementen te ontdekken.

Terugkomend op de functies van histon modificaties, is een systematische benadering om de functies van combinatorische histon modificaties te begrijpen, een genoomanalyse geweest van genexpressie veranderingen waargenomen in histon mutanten. In dergelijke studies wordt meestal gevonden dat histonmutanten relatief weinig fenotypische complexiteit vertonen als gevolg van verschillende combinaties van histonmutanten. Dit komt zowel naar voren in studies die zich richten op specifieke histon-puntmutanten en hun combinaties, als in studies die zich richten op deletiemutanten van histon-modificerende enzymen. Zo hebben wij bijvoorbeeld systematisch alle 16 mogelijke combinatorische mutaties tussen de 4 lysines in de histon H4 staart onderzocht, waarbij wij ontdekten dat mutatie van drie van de residuen (lysines 5, 8 en 12) niet te onderscheiden effecten had op de genexpressie, terwijl werd bevestigd dat lysine 16 unieke effecten had op de genexpressie (Dion et al, PNAS 2005). Bovendien waren genexpressiedefecten in combinatorische mutanten weinig verschillend van lineaire combinaties van de componentmutaties – met andere woorden, het effect van de H4K5,16R dubbele mutant op genexpressie kon worden voorspeld door de K5R en K16R datasets bij elkaar op te tellen.

In tegenstelling tot de bescheiden effecten van veel histon-modificerende verwijderingen waargenomen bij steady-state, suggereren single-gen studies dat chromatine regulatoren belangrijke rollen hebben in dynamische processen die worden gemaskeerd bij steady-state. Dit heeft ons gemotiveerd om chromatine regulatoren te bestuderen in de context van transcriptionele herprogrammering, met behulp van diamide stress in gist als een handig paradigma voor het induceren van massale transcriptionele veranderingen (Weiner et al, PLoS Bio 2012). Wij vinden dat de meerderheid van de chromatine regulatoren hebben grotere effecten op gen inductie / repressie kinetiek dan ze doen op steady-state mRNA-niveaus, de bevestiging dat dynamische studies kunnen onverwachte functies voor chromatine regulatoren te identificeren. Het groeperen van deletiemutanten met vergelijkbare genexpressiedefecten identificeert bekende complexen, en dat gezamenlijke analyse van histonmutanten en deletiemutanten veel histon-modificerende enzymen associeert met hun doelsites. Door functionele gegevens te combineren met genoom-wijde karteringsgegevens, hebben we een verrassende rol gevonden voor Set1-afhankelijke H3K4 methylering (een “activerende” markering) in de repressie van ribosomale biogenese genen. Samen bieden deze gegevens een rijke multi-modale kijk op de rol van chromatine regulatoren in gen-inductie en repressie dynamiek, en suggereren dat het begrijpen van de talloze rollen van chromatine structuur in genregulatie op een genoom-brede schaal zal vereisen dat mutant analyses worden uitgebreid tot kinetische studies.

Chromosoom vouwen

Hoewel de 1-dimensionale structuur van chromatine steeds beter begrepen wordt, is ons begrip van de 3-dimensionale vouwing van het genoom in de kern van oudsher achtergebleven. In het afgelopen decennium is deze kloof echter drastisch verkleind dankzij de ontwikkeling door Dekker en collega’s van de 3C-familie (Chromosome Conformation Capture) van technieken. Bij deze methoden wordt chromatine in vivo aan crosslinking onderworpen om interacties tussen chromosomale loci vast te leggen. Het genoom wordt vervolgens gefragmenteerd, meestal met restrictie-enzymen, en DNA-ligatie wordt gebruikt om interacties vast te leggen tussen chromosomale loci die in vivo met elkaar in contact waren. De overvloed aan ligatieproducten tussen twee chromosoomregio’s wordt vaak geïnterpreteerd als een maat voor de frequentie/waarschijnlijkheid van contact, of nabijheid, tussen het paar loci, waardoor een beeld van de chromosoomstructuur wordt verkregen dat enigszins analoog is aan het beeld van de eiwitstructuur dat met NMR-technieken wordt verkregen. Genoom-brede varianten van 3C, zoals Hi-C, hebben een aantal organisatorische kenmerken van eukaryote genomen met steeds fijnere resoluties onthuld, van de schaal van volledige chromosomale gebieden, tot multi-Mb actieve en inactieve compartimenten, tot honderden-kb contactdomeinen (TAD’s), tot enhancer-promoter lussen.

Wat veel factoren van invloed op de effectieve resolutie van een 3C / Hi-C dataset, met inbegrip van sequencing diepte en bibliotheek complexiteit, een cruciale limiet voor genomische resolutie is de grootte van de fragmenten gegenereerd voordat fysieke interacties worden vastgelegd via ligatie. Aangezien de meerderheid van de 3C-gebaseerde experimenten vertrouwen op restrictie-enzymen voor fragmentatie van het genoom, zijn ze beperkt tot ~ 1 kb resolutie op zijn best. Om de resolutie van 3C-gebaseerde technieken te verbeteren, hebben we daarom een hoge resolutie 3C-gebaseerde techniek, genaamd “Micro-C”, waarin fragmentatie van het genoom wordt bereikt met behulp van micrococcal nuclease (MNase) tot mononucleosoom-resolutie analyse van chromosoom vouwen mogelijk te maken. De verbeterde resolutie geboden door Micro-C kon de identificatie van chromosomaal-interacting domeinen – “CIDs” – in ontluikende gist die niet eerder waren gewaardeerd met behulp van een restrictie-enzym-gebaseerde 3C techniek (Hsieh et al, Cell 2015). Een herzien Micro-C protocol waarin lange crosslinkers, die we “Micro-C XL” genoemd, niet alleen recapituleerde de lokale chromatine structuren eerder onthuld door Micro-C, maar ook robuust herstelde hogere-orde kenmerken zoals centromeer-centromeer interacties (Hsieh et al, Nature Methods 2016).

Onze methode biedt inzicht in gist genoom vouwen op alle lengte schalen van belang. Op grotere schalen, de Rabl configuratie van chromosomen wordt gezien als clustering van centromeren, en interacties tussen de telomeren van chromosoom armen van vergelijkbare lengte. Centromeric chromatine toont ook een karakteristieke “X” vorm als gevolg van de twee armen van het chromosoom zowel statistisch weg van het centromeer samen in een haarspeld-achtige structuur voor sommige ~ 20 kb, terwijl centromeren zijn relatief geïsoleerd van chromosoom armen. Op hogere resolutie (figuur 3), genen in zowel budding en splijting gist zijn georganiseerd in chromosomally-interacting domeinen (CID’s), meestal verspreid over 1-5 genen, die in sommige opzichten vergelijkbaar met de “topologisch-associating domeinen” beschreven in een veelheid van andere modelorganismen. Grenzen tussen CID’s komen voor bij actieve promotors, hoog-geëxpresseerde genen, en tRNA genen. De overeenstemming van meerdere onafhankelijke benaderingen van de analyse van chromosoomvouwing geeft hoop dat we een echt begrip van de structuren die door chromosomen in de cel worden aangenomen, naderen.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.