クロマチンの構造と機能

Nucleosome positioning

真核生物のゲノムはヌクレオソームと呼ばれる繰り返しサブユニットにパッケージされており、これは146bpのDNAが塩基性ヒストン蛋白質の8量体にほぼ2回巻きついているものである。 転写からDNA修復、組換えまで、真核生物のDNA取引はすべてこのヌクレオソームのパッケージングの中で行われる。 ヌクレオソームに巻きついているDNAと、ヌクレオソーム間に位置するDNAは、アクセス性や構造的性質が異なるため、ゲノムに沿ったヌクレオソームの正確な位置は、ゲノムの機能を理解する上で非常に重要であることが分かっています。 ある意味では、ゲノムのクロマチン包装は、重要な制御DNA要素を交互に隠したりさらしたりしてゲノムの出力に影響を与える「フィルターセット」と考えることができ、同じDNA分子がその正確な包装状態に応じて複数の異なる機能プログラムを発現することを可能にするのである。 私たちの研究室では、ゲノムの構造生物学に長い間関心を寄せてきました。ゲノムのパッケージングの根底にあるルールは何か、パッケージング状態の違いによる機能的な意味は何か。 例えば、ヌクレオソーム位置のゲノムマップを作成するには、マイクロコッカルヌクレアーゼ(MNase)がヌクレオソームDNAよりもリンカーDNAを好むことを利用して、MNase消化後に残ったDNA断片をサイズ分離すると、単位サイズが繰り返される規則的な「ラダー」になる。 このようにして得られた一塩基サイズの断片をタイリングアレイやディープシーケンス(MNase-seq)によりゲノム規模で解析すると、ヌクレオソームで保護された領域のカタログが得られ(Yuan et al, Science 2005)、ほとんどの細胞集団で同じ位置に存在する「よく位置する」ヌクレオソームの位置と、細胞間でヌクレオソーム位置が異なる「ファジー」領域の位置が明らかになりました。 これらの初期のヌクレオソームマップから得られた最大の驚きは、出芽酵母のヌクレオソームの大部分(約70%)が比較的良い位置にあるという事実でした。これは、大部分のゲノムDNAがヌクレオソームへの組み込みに対して本質的な熱力学的優先性をほとんど持たないという、長年理解されてきた事実にもかかわらず、です。 私たちは、従来の遺伝学的アプローチ(Weiner et al, Genome Res 2010)と比較ゲノム研究(Tsankov et al, PLoS Bio 2010、Hughes et al, Mol Cell 2012)の両方を用いて、出芽酵母のヌクレオソームポジショニングの側面を調査し、生体内でのヌクレオソームのポジショニングを担う力を明らかにすることを続けている。

酵母のヌクレオソームマップから学んだことは、ゲノム全体のヌクレオソームマッピングの対象となる多くの種において、多くの重要なコンセプトが浮かび上がり、概ね一般的であることが証明されています(図1)。 まず、活性化されたプロモーターと活性化されたエンハンサーは、ヌクレオソームが欠乏していることがわかった。 第二に、調節エレメントに隣接するヌクレオソームは、うまく配置されている。 このため、境界ヌクレオソームから遠く離れた場所(約1000-2000bp)では、ヌクレオソームテンプレートが曖昧になることが分かっています。 これは、RNAポリメラーゼIIとその関連因子の作用によると考えられる。 最後に、ヌクレオソーム鋳型の密度(隣接する2つのヌクレオソーム間の平均距離)は、主にトランス因子によって変化する可能性があります。 私たちは、アンサンブル測定の1分子分解に積極的に取り組みながら、酵母におけるヌクレオソーム位置決めの研究をある程度続けています。

ヒストンのダイナミクス

エピゲノムアッセイは、複雑な細胞状態のスナップショットを捉えます。 安定性の高いDNA配列とは異なり、クロマチンは非常に動的であるため、クロマチン構造を支配する関連する時間スケールについての疑問が生じます。 この問題は、細胞集団内の不均質性の問題と関連するが、それとは異なる。 アンサンブル測定で「ファジー」なヌクレオソームを観察したとき、その位置は細胞分裂のときだけ変わるのか(安定)、それとも数秒ごとに変わるのか(動的)、幅広いタイムスケールがアンサンブル観察と単一細胞の状態分布の両方に一致する。 この問題は、長距離の染色体相互作用からヌクレオソームの化学修飾まで、生体内で見出される構造の範囲全体に当てはまります。 観測された構造の機能を理解するには、最終的に問題の構造に関連する時間スケールを知る必要があります。

ゲノム全体のクロマチン動態を特徴付けるために、我々は遺伝子にコードされたピューレチェイス法を適応して、ゲノム全体の複製に依存しないヌクレオソーム回転率を特徴付けました (Dion et al, Science 2007)。 これらの研究により、転写される遺伝子では複製によらないターンオーバーが起こり、特に制御領域(プロモーターやエンハンサー)ではヒストンの置換が急速に起こっていることが明らかになりました。 私たちの研究室を含む多くの研究室による変異体研究により、ヒストンの置換を担う細胞内装置のメカニズムに関する洞察が可能となりました。

より長い時間スケールでは、ヒストンの動態の問題は、クロマチン状態が世代を超えてコピーされる仕組みの理解にとって鍵となります。 クロマチンの状態が継承されるメカニズムを理解するためには、複製中のヒストン蛋白質のダイナミクスがもたらすユニークな課題を理解することが必要である。 まず、ゲノム複製時には、複製分枝の通過によってヒストンとDNAの結合が乱れ、古いヒストンは母染色体上の元の位置に近い場所で娘染色体に再結合しなければならない。 そうでなければ、遺伝子座特異的なエピジェネティック情報は、世代ごとにランダムにシャッフルされてしまう。 第二に、古いヒストンは新しいゲノム上のヒストンの半分しかなく、残りのヒストンは各S期に新たに合成されます。

ゲノム複製中のヌクレオソーム移動の程度を測定する試みとして、van Leeuwen 研究所が開発した遺伝子パルスチェイスシステムを利用した。このシステムでは、Cre-Lox 組換えを誘発すると、エピトープタグが付いたヒストン H3 から新しいエピトープタグに切り替わる。 このシステムにより、先祖のH3タグを切り離し、その後、数回の細胞分裂にわたって先祖のH3のゲノム上の位置を追跡することが可能になった(Radman-Livaja et al, PLoS Bio 2011)。 驚いたことに、古いヒストン蛋白質はサブテロメアなどのエピジェネティックに制御された遺伝子座には蓄積されず、長くて転写率の低い遺伝子の5’末端に蓄積されることがわかりました。 また、古いヒストンがコード領域にそって3’から5’へ移動することや、複製時のヒストンの移動が、祖先ヒストンの保持のパターンを説明するのに必要であることがわかった。 その結果、ヒストンが娘ゲノムに再接続されるのは、ヒストンが切断された位置ではなく、母方のヒストンが複製中に元の位置から400bp以内の範囲に留まることがわかり、この重要なパラメータを初めて測定することができました。 このことから、クロマチンの状態の継承は、1ヌクレオソーム単位ではなく、5〜10ヌクレオソームドメインのスケールで行われることが必要であることがわかりました。

ヒストン修飾

クロマチン繊維のビーズオンザストリング構造は、一様なビーズで構成されているわけではなく、個々のヌクレオソームの化学組成は原理的にヌクレオソームごとに非常に変わりやすく、ゲノム機能に対して重要な影響を与える。 ヒストン蛋白質は化学的に修飾されることが可能であり、ヒストン蛋白質の複数の残基で非常に多様な翻訳後修飾(アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、その他多数)が起こっていることが最も顕著な例である。 これらの化学修飾は、ヌクレオソームの化学的および物理的特性を変化させるだけでなく、修飾状態を認識するタンパク質による結合を調節する(たとえば、トリメチル化H3K4にのみ結合する)役割を果たす。

この驚くべきヒストン修飾の多様性は、それが何を意味しているのかという疑問に自然につながる–なぜ細胞内で非常に多くのヒストン修飾が起こるのだろうか? 私たちは、コンビナトリアルな複雑さがクロマチン調節にどのように寄与しているかという問題に長い間、関心を寄せてきました。 また、修飾の特定の組み合わせと特定の結果を結びつけて、暗号を解読することができるのでしょうか? 私たちは、1)モノヌクレオソーム分解能でのヒストン修飾のゲノムワイドなマッピング(Liu et al, PLoS Bio 2005, Weiner et al, Mol Cell 2015)、2)変異ヒストンまたはヒストン修飾酵素の欠損を持つ出芽酵母における転写変化の解析(Dion et al, PNAS 2005, Weiner et al, PLoS Bio 2012)に基づいて、これらの疑問に対する二つのアプローチを取っています。

最初にゲノム マッピングに焦点を当て、複数のモデル系におけるヒストン状態マッピングの大規模な取り組みにより、クロマチン構造について保存された多くの側面が明らかにされました。 まず、転写のプロセスは、RNAポリメラーゼの開始型(遺伝子の5’末端)と伸長型(中間および3’末端)によって異なるヒストン修飾が付加され、クロマチンに膨大な足跡を残す。 遺伝子の5’末端には、H3K4 di/tri-methylation(H3K4me3)、H3およびH4 tail hyper acetylation(H3K4/9/14/18/27ac and H4K5/8/12ac), H3.3 and H2A.Z variants, and H3K56 acetylationなどのマークが存在する。 遺伝子本体のヌクレオソームは、通常、H3K36me3とH3K79me3でマークされ、一般にヒストン尾部のアセチル化はやや減少している。 第二に、エンハンサーなどの遠位制御エレメントはH3K4me1/2でマークされるが、H3K4me3ではマークされない。 その他のヒストンマーキングは、抑制されたエンハンサー、ポイズドエンハンサー、活性エンハンサーを区別し、H3K27メチル化とアセチル化はそれぞれ抑制エンハンサーと活性エンハンサーをマークしている。 第三に、抑制性クロマチンの2つの主要な形態は、特定のヒストン修飾と関連している。 古典的なヘテロクロマチン(テロメアや多くの反復配列を含む)はH3K9メチル化でマークされ、ポリコーム群因子によって抑制された遺伝子はH3K27me3でマークされる。 H3K27メチル化ヌクレオソームは、抑制された状態で他のマークを持たない場合と、活性マークH3K4me3と結合して「二価」の状態に保たれる場合がある。 最後に、セントロメアに結合したヌクレオソームはしばしばH3様CENP-Aタンパク質を含み、M期にはヌクレオソームの広い周辺領域がH3S10phで標識される。 ヒストン修飾の機能については、ヒストン変異体で観察される遺伝子発現の変化を全ゲノム解析することで、ヒストン修飾の組み合わせの機能を理解する系統的なアプローチが行われてきた。 このような研究では、通常、ヒストン変異体は、ヒストン変異体の異なる組み合わせから生じる表現型の複雑さは比較的少ないことが分かっている。 これは、特定のヒストン点変異体とその組み合わせに注目した研究でも、ヒストン修飾酵素の欠失変異体に注目した研究でも同様である。 例えば、ヒストンH4尾部の4つのリジンの組み合わせ可能な16の変異をすべて系統的に調べたところ、3つの残基(リジン5、8、12)の変異は遺伝子発現に区別できない影響を与えるが、リジン16は遺伝子発現に独特の影響を与えることが確認された(Dion et al, PNAS 2005)。 さらに、組み合わせ変異体における遺伝子発現の欠損は、構成する変異の線形結合とほとんど変わらなかった。言い換えれば、遺伝子発現に対するH4K5,16R二重変異体の効果は、K5RとK16Rのデータセットを一緒に加えることによって予測することができた<6870><4657>多くのヒストン修飾欠損の効果が定常状態で観察される控えめなものとは対照的に、単一遺伝子研究はクロマチンレギュレーターが定常状態でマスクされてしまう動的プロセスにおいて、重要な役割を持つことを示唆した。 そこで私たちは、酵母のジアミドストレスを大規模な転写変化を誘導する便利なパラダイムとして用い、転写のリプログラミングという文脈でクロマチンレギュレーターを研究することにしました(Weiner et al, PLoS Bio 2012)。 その結果、クロマチン制御因子の大半は、定常状態のmRNAレベルよりも遺伝子の誘導・抑制の動態に大きな影響を与えることがわかり、動的な研究によってクロマチン制御因子の予期せぬ機能を特定できることが確認されました。 また、ヒストン変異体や欠失変異体を用いた解析により、多くのヒストン修飾酵素とその標的部位が関連づけられることを明らかにした。 また、機能データとゲノムワイドマッピングデータを組み合わせることで、リボソーム生合成遺伝子の抑制においてSet1依存的なH3K4メチル化(「活性化」マーク)が果たす驚くべき役割を同定した。 これらのデータは、遺伝子の誘導と抑制のダイナミクスにおけるクロマチンレギュレーターの役割に関する豊富なマルチモダルビューを提供し、ゲノム規模での遺伝子制御におけるクロマチン構造の無数の役割を理解するには、突然変異体解析からキネティック研究まで拡大する必要があることを示唆している。 しかし、Dekkerらが開発した3C(Chromosome Conformation Capture)技術により、過去10年間でこのギャップは劇的に縮まっている。 これらの方法では、クロマチンを生体内で架橋し、染色体座位間の相互作用を捕らえる。 次に、ゲノムを制限酵素で断片化し、DNAライゲーションを用いて、生体内で互いに接触していた染色体座の間の相互作用を捕らえる。 2つの染色体領域間のライゲーション産物の量は、しばしば、一対の遺伝子座の接触頻度/確率、すなわち近接度の尺度として解釈され、NMR技術によって得られるタンパク質構造の見解に類似した染色体構造の見解を提供するものである。 Hi-Cのようなゲノムワイドな3Cの変種により、真核生物ゲノムの多くの組織的特徴が、染色体領域全体のスケールから、数MBの活性および不活性区画、100KBの接触ドメイン(TADs)、エンハンサー-プロモーターループまで、ますます細かい分解能で明らかにされている。

シーケンスの深さやライブラリーの複雑さなど、3C/Hi-Cデータセットの有効な分解能には多くの要因が影響しますが、ゲノム分解能に対する決定的な限界は、物理的相互作用がライゲーションによって捉えられる前に生成される断片の大きさです。 3C実験の多くは制限酵素によるゲノムの断片化に頼っているため、分解能はせいぜい1 kb程度に留まっている。 そこで私たちは、マイクロコッカルヌクレアーゼ(MNase)を用いてゲノムを断片化し、染色体の折りたたみをモノヌクレオソーム分解能で解析する高解像度3C技術を開発しました。 Micro-Cによる分解能の向上により、出芽酵母において、制限酵素を用いた3C技術ではこれまで評価できなかった染色体間相互作用ドメイン(CID)の同定が可能になりました(Hsieh et al, Cell 2015)。 私たちが「Micro-C XL」と名付けた、長い架橋剤を組み込んだ改訂版Micro-Cプロトコルは、以前にMicro-Cによって明らかにされた局所的なクロマチン構造を再現するだけでなく、セントロメア-セントロメア相互作用などの高次の特徴も強固に回復しました(Hsieh et al, Nature Methods 2016)<6870><4657>我々の方法は、関心対象のすべての長さスケールにおける酵母ゲノム折り畳みの洞察を提供するものです。 より大きなスケールでは、染色体のRabl構成はセントロメアのクラスタリング、および同様の長さの染色体アームのテロメア間の相互作用として見られる。 また、セントロメア型クロマチンは、染色体の両腕が統計的にセントロメアから離れる方向に一緒にヘアピン状の構造で約20kbに及ぶことから、特徴的な「X」字型を示すが、セントロメアは染色体腕から比較的隔離されている。 出芽酵母と分裂酵母の遺伝子は、より高い分解能(図3)で、通常1-5個の遺伝子からなる染色体相互作用ドメイン(CID)に組織化されており、他の多くのモデル生物に見られる「位相的関連ドメイン」と類似している点がある。 CID間の境界は、活性プロモーター、高発現遺伝子、tRNA遺伝子で発生する。 染色体フォールディングの分析に対する複数の独立したアプローチの一致は、細胞内で染色体が採用する構造の真の理解に近づいているという希望を与えている。

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