Struktur und Funktion des Chromatins

Positionierung der Nukleosomen

Das eukaryotische Genom ist in einer sich wiederholenden Untereinheit verpackt, die als Nukleosom bekannt ist und aus 146 bp DNA besteht, die fast zweimal um ein Oktamer aus basischen Histonproteinen gewickelt ist. Alle eukaryotischen DNA-Transaktionen, von der Transkription über die DNA-Reparatur bis hin zur Rekombination, finden im Zusammenhang mit der Verpackung dieses Nukleosoms statt. Da sich die um das Nukleosom gewickelte DNA und die zwischen den Nukleosomen liegende DNA in ihrer Zugänglichkeit und ihren strukturellen Eigenschaften unterscheiden, hat sich die genaue Lage der Nukleosomen entlang des Genoms als sehr wichtig für das Verständnis der Funktion des Genoms erwiesen. In gewissem Sinne kann man sich die Chromatinverpackung des Genoms als einen „Filtersatz“ vorstellen, der die Genomleistung beeinflusst, indem er wichtige regulatorische DNA-Elemente abwechselnd verbirgt oder freilegt, so dass ein und dasselbe DNA-Molekül je nach seinem genauen Verpackungszustand mehrere unterschiedliche Funktionsprogramme zum Ausdruck bringen kann. Unser Labor ist seit langem an der Strukturbiologie des Genoms interessiert – welche Regeln liegen der genomischen Verpackung zugrunde, und welche funktionellen Auswirkungen haben die verschiedenen Verpackungszustände?

Wir haben uns auf die Hefe S. cerevisiae als geeigneten Modellorganismus für die genomweite Untersuchung der Chromatinstruktur konzentriert und genomweite Methoden zur Analyse der Chromatinarchitektur entwickelt. Um genomweite Karten der Nukleosomenpositionierung zu erstellen, machen wir uns beispielsweise die Tatsache zunutze, dass die Mikrokokken-Nuklease (MNase) Linker-DNA gegenüber nukleosomaler DNA bevorzugt – die Größentrennung der nach dem MNase-Verdau verbleibenden DNA-Fragmente ergibt eine regelmäßige „Leiter“ mit sich wiederholenden Größeneinheiten. Die genomweite Analyse der resultierenden mononukleosomengroßen Fragmente mittels Tiling Array oder Deep Sequencing (MNase-seq) liefert dann einen Katalog nukleosomengeschützter Regionen (Yuan et al., Science 2005), der sowohl Standorte „gut positionierter“ Nukleosomen, die in den meisten Zellen an derselben Stelle vorhanden sind, als auch Standorte „unscharfer“ Regionen, in denen die Lage der Nukleosomen von Zelle zu Zelle variiert, offenbart. Eine der größten Überraschungen dieser frühen Nukleosomenkarten war die Tatsache, dass die Mehrheit der Nukleosomen (~70%) in der Hefe relativ gut positioniert ist, trotz der seit langem bekannten Tatsache, dass die überwiegende Mehrheit der genomischen DNA wenig bis keine intrinsische thermodynamische Präferenz für den Einbau in Nukleosomen hat. Wir haben weitere Aspekte der Nukleosomenpositionierung in der Hefe untersucht, wobei wir sowohl traditionelle genetische Ansätze (Weiner et al, Genome Res 2010) als auch vergleichende genomische Studien (Tsankov et al, PLoS Bio 2010, Hughes et al, Mol Cell 2012) verwendet haben, um die für die Nukleosomenpositionierung in vivo verantwortlichen Kräfte zu beleuchten.

Die aus den Nukleosomenkarten der Hefe gezogenen Lehren haben sich bei einer Vielzahl von Arten, die einer genomweiten Nukleosomenkartierung unterzogen werden, weitgehend als allgemein gültig erwiesen, wobei sich eine Reihe von Schlüsselkonzepten herauskristallisiert hat (Abbildung 1). Erstens sind aktive und ruhende Promotoren nukleosomenarm, ebenso wie aktive Enhancer. Zweitens sind die Nukleosomen, die an regulatorische Elemente grenzen, gut positioniert. Die Nukleosomen werden mit abnehmender Präzision in größeren Abständen positioniert, was zu einer unschärferen Nukleosomenvorlage in größerer Entfernung (~1000-2000bp) von den Grenznukleosomen führt. Drittens weisen stark transkribierte Gene tendenziell eine geringere Nukleosomenbelegung und eine weniger präzise Positionierung auf, was höchstwahrscheinlich auf die Wirkung der RNA-Polymerase II und der damit verbundenen Faktoren zurückzuführen ist. Schließlich kann die Dichte der Nukleosomenvorlage (durchschnittlicher Abstand zwischen zwei benachbarten Nukleosomen) variieren, was meist auf trans-Faktoren zurückzuführen ist. Wir untersuchen die Positionierung von Nukleosomen in Hefe in gewissem Umfang weiter, wobei wir ein aktives Interesse an der Zerlegung von Ensemble-Messungen in einzelne Moleküle haben.

Histon-Dynamik

Epigenomische Tests erfassen Momentaufnahmen komplexer zellulärer Zustände. Im Gegensatz zur DNA-Sequenz, die sehr stabil ist, kann Chromatin sehr dynamisch sein, was die Frage nach den relevanten Zeitskalen aufwirft, die die Chromatinstrukturen bestimmen. Diese Frage hängt mit der Frage nach der Heterogenität innerhalb einer Zellpopulation zusammen, unterscheidet sich aber von ihr. Wenn wir ein „unscharfes“ Nukleosom in einer Ensemble-Messung beobachten, ändert sich die Lage des Nukleosoms nur bei der Zellteilung (stabil) oder alle paar Sekunden (dynamisch) – ein breites Spektrum an Zeitskalen ist sowohl mit der Ensemble-Beobachtung als auch mit der Verteilung der Einzelzellzustände vereinbar. Diese Frage gilt für alle in vivo gefundenen Strukturen, von weitreichenden chromosomalen Interaktionen bis hin zu chemischen Veränderungen der Nukleosomen. Um die Funktion der beobachteten Strukturen zu verstehen, müssen letztlich die relevanten Zeitskalen für die betreffenden Strukturen bekannt sein.

Um die Chromatindynamik genomweit zu charakterisieren, haben wir genetisch kodierte Pule-Chase-Methoden angepasst, um die Replikations-unabhängigen Nukleosomen-Umsatzraten genomweit zu charakterisieren (Dion et al, Science 2007). Diese Studien zeigen einen replikationsunabhängigen Umsatz bei transkribierten Genen, wobei der Histonersatz in regulatorischen Regionen (Promotoren und Enhancern) besonders schnell erfolgt. Mutantenstudien aus vielen Labors, darunter auch unserem, haben mechanistische Einblicke in die zelluläre Maschinerie ermöglicht, die für den Histonersatz verantwortlich ist.

Über längere Zeiträume hinweg ist die Frage der Histondynamik der Schlüssel zum mechanistischen Verständnis, wie Chromatinzustände von einer Generation zur nächsten kopiert werden. Um den Mechanismus zu verstehen, durch den Chromatinzustände vererbt werden könnten, ist es notwendig, die einzigartigen Herausforderungen zu verstehen, die die Dynamik der Histonproteine während der Replikation darstellt. Erstens werden während der Genomreplikation durch die Bewegung der Replikationsgabel die Histon-DNA-Kontakte unterbrochen, und alte Histone müssen sich mit den Tochterchromosomen an einer Stelle reassoziieren, die nahe ihrer ursprünglichen Position auf dem Mutterchromosom liegt. Andernfalls würde die ortsspezifische epigenetische Information in jeder Generation zufällig neu verteilt werden. Zweitens machen alte Histone nur die Hälfte der Histone auf jedem neuen Genom aus, und die restlichen Histone werden in jeder S-Phase neu synthetisiert. Dies impliziert einen gewissen Informationsübergang von alten zu neuen Histonen, da andernfalls alte Chromatinzustände schnell durch neue Histone verwässert würden.

Um zu versuchen, das Ausmaß der Nukleosomenbewegung während der Genomreplikation zu messen, nutzten wir ein vom van Leeuwen-Labor entwickeltes genetisches Puls-Chase-System, bei dem die Induktion der Cre-Lox-Rekombination zu einem Wechsel von einem Epitop-markierten Histon H3 zu einem neuen Epitop-Tag führt. Dieses System ermöglichte es uns, ein altes H3-Tag auszuschalten und anschließend die genomische Anordnung des alten H3 über mehrere Zellteilungen hinweg zu verfolgen (Radman-Livaja et al, PLoS Bio 2011). Zu unserer großen Überraschung stellten wir fest, dass sich alte Histonproteine nicht an epigenetisch regulierten Loci wie den Subtelomeren anreichern, sondern stattdessen an den 5′-Enden von langen, schlecht transkribierten Genen. Wie erwartet, akkumulieren alte Histone nicht an Orten mit schnellem Histonumsatz, aber wir fanden auch heraus, dass die 3′-5′-Bewegung alter Histone entlang kodierender Regionen und die Histonbewegung während der Replikation erforderlich sind, um die von uns beobachteten Muster der Retention alter Histone zu erklären. Vor allem aber haben wir festgestellt, dass sich alte Histone nicht genau an dem Ort mit den Tochtergenomen reassoziieren, von dem aus sie sich abgespalten haben, sondern dass mütterliche Histone während der Replikation innerhalb von ~400 bp ihrer ursprünglichen Position verbleiben, was die erste Messung dieses entscheidenden Parameters darstellt. Die Vererbung von Chromatinzuständen muss also auf der Skala von ~5-10 Nukleosomen-Domänen und nicht auf der Ebene eines einzelnen Nukleosoms erfolgen. Diese Ergebnisse schränken daher die maximale Informationsmenge ein, die theoretisch vom Chromatin zwischen den Generationen übertragen werden kann.

Histonmodifikationen

Die Perlen auf einer Schnur-Struktur der Chromatinfaser besteht nicht aus einheitlichen Perlen, da die chemische Zusammensetzung der einzelnen Nukleosomen im Prinzip von Nukleosom zu Nukleosom extrem variabel sein kann, mit wichtigen Folgen für die Genomfunktion. Am dramatischsten ist, dass die Histonproteine chemisch modifiziert werden können, wobei eine ungeheure Vielfalt an posttranslationalen Modifikationen (Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Ubiquitylierung und viele mehr) an mehreren Resten in allen Histonen vorkommt. Diese chemischen Modifikationen können die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Nukleosoms verändern, dienen aber auch dazu, die Bindung durch Proteine zu modulieren, die den modifizierten Zustand erkennen (z. B. binden sie nur an tri-methyliertes H3K4).

Diese unglaubliche Vielfalt an Histonmodifikationen führt natürlich zu der Frage, was das alles bedeutet – warum kommen so viele Histonmodifikationen in der Zelle vor? Wir interessieren uns seit langem für die Frage, wie die kombinatorische Komplexität zur Regulierung des Chromatins beiträgt. Wie viele verschiedene Kombinationen von Modifikationen treten auf (Abbildung 2), und können bestimmte Kombinationen von Modifikationen mit bestimmten Ergebnissen in Verbindung gebracht werden, so dass der Code entschlüsselt werden kann? Wir haben uns diesen Fragen auf zwei Arten genähert: 1) durch genomweite Kartierung von Histonmodifikationen in Mononukleosomen-Auflösung (Liu et al., PLoS Bio 2005, Weiner et al., Mol Cell 2015) und 2) durch die Analyse von Transkriptionsveränderungen in Knospenhefen, die entweder mutierte Histone oder Deletionen von histonmodifizierenden Enzymen tragen (Dion et al., PNAS 2005, Weiner et al., PLoS Bio 2012).

Wenn man sich zunächst auf die genomische Kartierung konzentriert, offenbaren groß angelegte Bemühungen zur Kartierung des Histonzustands in mehreren Modellsystemen eine Reihe konservierter Aspekte der Chromatinstruktur. Erstens hinterlässt der Transkriptionsprozess einen massiven Fußabdruck auf dem Chromatin, mit unterschiedlichen Histonmodifikationen, die von den Initiations- (5′-Ende der Gene) und Elongationsformen (mittleres und 3′-Ende) der RNA-Polymerase hinterlassen werden. Zu den Markierungen am 5′-Ende von Genen gehören H3K4-Di-/Tri-Methylierung (H3K4me3), H3- und H4-Schwanzhyperacetylierung (H3K4/9/14/18/27ac und H4K5/8/12ac), H3.3- und H2A.Z-Varianten sowie H3K56-Acetylierung. Genkörper-Nukleosomen sind typischerweise mit H3K36me3 und H3K79me3 markiert und weisen im Allgemeinen wenig Histonschwanz-Acetylierungen auf. Zweitens sind distale regulatorische Elemente, wie z. B. Enhancer, mit H3K4me1/2, nicht aber mit H3K4me3 markiert. Andere Histonmarkierungen unterscheiden unterdrückte, ruhende und aktive Enhancer, wobei H3K27-Methylierung und Acetylierung unterdrückte bzw. aktive Enhancer markieren. Drittens gibt es zwei Hauptformen von repressivem Chromatin, die mit spezifischen Histonmodifikationen verbunden sind. Klassisches Heterochromatin (einschließlich Telomere und viele repetitive Sequenzen) ist mit H3K9-Methylierung gekennzeichnet, während Gene, die durch Polycomb-Faktoren unterdrückt werden, mit H3K27me3 markiert sind. H3K27-methylierte Nukleosomen können sich entweder in einem unterdrückten Zustand befinden und keine anderen Markierungen aufweisen, oder in einem ausgeglichenen „bivalenten“ Zustand in Kombination mit der aktiven Markierung H3K4me3. Schließlich enthalten Nukleosomen, die mit Zentromeren assoziiert sind, häufig das H3-ähnliche CENP-A-Protein, und während der M-Phase ist eine breite perizentrische Domäne von Nukleosomen mit H3S10ph markiert. Insgesamt gibt es eine auffällige Übereinstimmung zwischen dem Histonstatus und der Funktion von Genomregionen, und deshalb ist die Kartierung von Histonmodifikationen eine wirksame Methode zur Entdeckung von Genen und regulatorischen Elementen.

Ein systematischer Ansatz zum Verständnis der Funktionen kombinatorischer Histonmodifikationen ist die Analyse des gesamten Genoms von Veränderungen der Genexpression, die bei Histonmutanten beobachtet wurden. Solche Studien zeigen in der Regel, dass Histonmutanten eine relativ geringe phänotypische Komplexität aufweisen, die sich aus verschiedenen Kombinationen von Histonmutanten ergibt. Dies zeigt sich sowohl in Studien, die sich auf spezifische Histon-Punktmutanten und deren Kombinationen konzentrieren, als auch in Studien, die sich auf Deletionsmutanten von histonmodifizierenden Enzymen konzentrieren. So haben wir beispielsweise systematisch alle 16 möglichen kombinatorischen Mutationen der 4 Lysine im Histon H4-Schwanz untersucht und festgestellt, dass die Mutation von drei der Reste (Lysine 5, 8 und 12) ununterscheidbare Auswirkungen auf die Genexpression hatte, während Lysin 16 nachweislich einzigartige Auswirkungen auf die Genexpression hatte (Dion et al., PNAS 2005). Darüber hinaus unterschieden sich die Defekte der Genexpression in kombinatorischen Mutanten kaum von linearen Kombinationen der Komponentenmutationen – mit anderen Worten, die Wirkung der H4K5,16R-Doppelmutante auf die Genexpression konnte durch Addition der K5R- und K16R-Datensätze vorhergesagt werden.

Im Gegensatz zu den bescheidenen Auswirkungen vieler histonmodifizierender Deletionen, die im Steady-State beobachtet wurden, legen Studien an einzelnen Genen nahe, dass Chromatinregulatoren wichtige Rollen in dynamischen Prozessen spielen, die im Steady-State maskiert sind. Dies hat uns dazu motiviert, Chromatinregulatoren im Kontext der transkriptionellen Reprogrammierung zu untersuchen, wobei wir Diamidstress in Hefe als geeignetes Paradigma für die Auslösung massiver transkriptioneller Veränderungen verwendet haben (Weiner et al, PLoS Bio 2012). Wir stellen fest, dass die meisten Chromatinregulatoren größere Auswirkungen auf die Kinetik der Geninduktion/-unterdrückung haben als auf den stationären mRNA-Spiegel, was bestätigt, dass dynamische Studien unerwartete Funktionen für Chromatinregulatoren identifizieren können. Durch die Gruppierung von Deletionsmutanten mit ähnlichen Defekten der Genexpression werden bekannte Komplexe identifiziert, und die gemeinsame Analyse von Histonmutanten und Deletionsmutanten bringt viele histonmodifizierende Enzyme mit ihren Zielstellen in Verbindung. Durch die Kombination funktioneller Daten mit genomweiten Kartierungsdaten konnten wir eine überraschende Rolle der Set1-abhängigen H3K4-Methylierung (eine „aktivierende“ Markierung) bei der Unterdrückung von Genen der ribosomalen Biogenese feststellen. Zusammengenommen bieten diese Daten eine reichhaltige multimodale Sicht auf die Rolle der Chromatinregulatoren bei der Geninduktion und -unterdrückung und legen nahe, dass das Verständnis der unzähligen Rollen der Chromatinstruktur bei der Genregulierung auf genomweiter Ebene eine Ausweitung der Mutantenanalysen auf kinetische Studien erfordert.

Chromosomenfaltung

Während die eindimensionale Struktur des Chromatins zunehmend besser verstanden wird, ist unser Verständnis der dreidimensionalen Faltung des Genoms im Zellkern traditionell zurückgeblieben. In den letzten zehn Jahren konnte diese Lücke jedoch dank der von Dekker und Kollegen entwickelten 3C-Techniken (Chromosome Conformation Capture) drastisch verkleinert werden. Bei diesen Methoden wird Chromatin in vivo vernetzt, um Wechselwirkungen zwischen chromosomalen Loci zu erfassen. Anschließend wird das Genom fragmentiert, in der Regel mit Restriktionsenzymen, und die DNA-Ligation wird verwendet, um Wechselwirkungen zwischen chromosomalen Loci zu erfassen, die in vivo miteinander in Kontakt waren. Die Häufigkeit der Ligationsprodukte zwischen zwei Chromosomenregionen wird häufig als Maß für die Häufigkeit/Wahrscheinlichkeit des Kontakts oder der Nähe zwischen den beiden Loci interpretiert und liefert ein Bild der Chromosomenstruktur, das in gewisser Weise dem von NMR-Techniken erzeugten Bild der Proteinstruktur entspricht. Genomweite 3C-Varianten wie Hi-C haben eine Reihe von Organisationsmerkmalen eukaryontischer Genome in immer feinerer Auflösung aufgedeckt, von der Größe ganzer chromosomaler Territorien über aktive und inaktive Kompartimente von mehreren MB bis hin zu Kontaktdomänen (TADs) von mehreren hundert KB und Enhancer-Promotor-Schleifen.

Während sich viele Faktoren auf die effektive Auflösung eines 3C/Hi-C-Datensatzes auswirken, darunter die Sequenzierungstiefe und die Komplexität der Bibliothek, ist eine entscheidende Grenze für die genomische Auflösung die Größe der Fragmente, die erzeugt werden, bevor die physikalischen Interaktionen durch Ligation erfasst werden. Da die meisten 3C-basierten Experimente auf Restriktionsenzyme zur Fragmentierung des Genoms angewiesen sind, sind sie bestenfalls auf eine Auflösung von ~1 kb beschränkt. Um die Auflösung von 3C-basierten Techniken zu verbessern, haben wir daher eine hochauflösende 3C-basierte Technik mit dem Namen „Micro-C“ entwickelt, bei der die Fragmentierung des Genoms mit Hilfe von Mikrokokken-Nuklease (MNase) durchgeführt wird, um eine Analyse der Chromosomenfaltung in Mononukleosomen-Auflösung zu ermöglichen. Die verbesserte Auflösung von Micro-C ermöglichte die Identifizierung von chromosomal interagierenden Domänen – „CIDs“ – in knospenden Hefen, die zuvor mit einer auf Restriktionsenzymen basierenden 3C-Technik nicht erkannt worden waren (Hsieh et al, Cell 2015). Ein überarbeitetes Micro-C-Protokoll mit langen Vernetzern, das wir „Micro-C XL“ nannten, rekapitulierte nicht nur die lokalen Chromatinstrukturen, die zuvor durch Micro-C aufgedeckt wurden, sondern zeigte auch robuste Merkmale höherer Ordnung wie Zentromer-Zentromer-Interaktionen (Hsieh et al, Nature Methods 2016).

Unsere Methode bietet Einblicke in die Faltung des Hefegenoms auf allen interessierenden Längenskalen. In größeren Maßstäben zeigt sich die Rabl-Konfiguration von Chromosomen als Clusterung von Zentromeren und Interaktionen zwischen den Telomeren von Chromosomenarmen ähnlicher Länge. Das zentromerische Chromatin zeigt auch eine charakteristische „X“-Form, die sich daraus ergibt, dass die beiden Arme des Chromosoms statistisch gesehen gemeinsam in einer haarnadelartigen Struktur über etwa 20 kb vom Zentromer wegführen, während die Zentromere relativ isoliert von den Chromosomenarmen sind. Bei höherer Auflösung (Abbildung 3) sind die Gene sowohl in der Knospen- als auch in der Spalthefe in chromosomal-interagierenden Domänen (CIDs) organisiert, die typischerweise 1-5 Gene umfassen und in gewisser Weise den „topologisch-assoziierenden Domänen“ ähneln, die in einer Vielzahl anderer Modellorganismen beschrieben sind. Grenzen zwischen CIDs treten an aktiven Promotoren, hochexprimierten Genen und tRNA-Genen auf. Die Übereinstimmung mehrerer unabhängiger Ansätze zur Analyse der Chromosomenfaltung lässt hoffen, dass wir uns einem echten Verständnis der Strukturen nähern, die Chromosomen in der Zelle annehmen.

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